由氨基酸組成的多肽數(shù)量驚人，情況非常復(fù)雜，由100個(gè)氨基酸聚合成線性分子，可形成20100種多肽。僅由Gly、Val、Leu三種氨基酸可以形成六種三肽。因此，確定多肽結(jié)構(gòu)，特別是長(zhǎng)鏈多肽結(jié)構(gòu)，是一項(xiàng)非常重要和復(fù)雜的工作。純單肽是確保肽結(jié)構(gòu)確認(rèn)的前提。杭州肽生物可為肽提供1-5種檢測(cè)報(bào)告。
多肽結(jié)構(gòu)分析方法
(一) 質(zhì)譜
經(jīng)典的多肽測(cè)序方法包括N末端序列測(cè)定的化學(xué)方法，如 Ed ** n法、C這些方法存在一些缺陷，如終端酶解和C終端化學(xué)降解。例如，N末端氨基酸苯異氰酸酯作為多肽和蛋白質(zhì)序列測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法( phenylisothiocyanate，PITC)分析法(即 Ed ** n法，又稱PTH法)，測(cè)序速度慢(每天50個(gè)氨基酸殘基)；樣品量大(nmol級(jí)或幾十pmol等級(jí))；對(duì)樣品純度要求很高；對(duì)氨基酸殘基的修飾往往有誤識(shí)別，而對(duì)N末端保護(hù)的肽鏈則無法測(cè)序。C因?yàn)檎也坏侥┒嘶瘜W(xué)降解測(cè)序法PITC這種理想的化學(xué)探針仍然面臨著巨大的困難。質(zhì)譜( ** ss spectrometry，MS)由于靈敏度高、準(zhǔn)確性高、操作方便，備受關(guān)注MS當(dāng)用于多肽序列測(cè)量時(shí)，隨著分子量的增加，靈敏度和準(zhǔn)確性顯著降低，因此使用MS多肽序列分析比蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單，許多研究都以多肽為分析對(duì)象。近年來，電噴霧電離質(zhì)譜( electrospray ionisation，ES)基質(zhì)輔助激光解吸譜( ** trix assisted laser desorption/ Ionization，MALD)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展和完善，使極性大分子多肽的分析成為可能，檢測(cè)限制fmol級(jí)，可測(cè)分子量范圍高達(dá)100kDa。目前MALD它已成為測(cè)量生物大分子特別是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)的有效工具。
(二)核磁共振
核磁共振是由于信號(hào)的純數(shù)字化、重疊范圍過寬(相對(duì)分子質(zhì)量過大)和信號(hào)弱等原因造成的( nuclear ** gnetic resonance，NMR)隨著二維、三維和維度的分析，圖譜在多肽分析中的應(yīng)用較少NMR分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展，NMR逐漸成為多肽分析的主要方法之一。NMR它可以用來確定氨基酸序列和定量混合物中的組分含量，但在多分析中仍有許多問題需要解決，如如何使分子量大的肽具有特定的形狀表面，便于定量和定性分析，如何縮短數(shù)據(jù)處理時(shí)間，許多學(xué)者正在研究這些問題，NMR對(duì)含少于30個(gè)氨基酸的多肽進(jìn)行分析更有效
近期超高場(chǎng)超導(dǎo)磁鐵的建設(shè)已經(jīng)到來NMR分子質(zhì)量范圍擴(kuò)大到100kD這么大的蛋白質(zhì)分子，其NMR譜帶增寬的問題， Wuthrich水平池豫優(yōu)化光譜法( transversal relaxation optimized spectroscop， TRDSY為此提供了解決方案
(三)紅外光譜儀儀
紅外光譜儀儀是識(shí)別有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的重要方法，具有樣品量小、不需要高純晶體的特點(diǎn)。通過紅外光譜儀儀研究肽的結(jié)構(gòu)和圖像，可以反映與正常生理?xiàng)l件（水溶液、溫度、酸堿度等）相似的生物大分子的結(jié)構(gòu)變化信息。
采用傅里葉紅外光譜儀儀的方法研究蛋白質(zhì)和肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，主要分析紅外光譜儀儀中的酰胺I譜帶（稱為酰胺I譜帶），酰胺I譜帶為α螺旋，β在1620~425000折疊、不規(guī)則卷曲、轉(zhuǎn)角等不同結(jié)構(gòu)振動(dòng)峰的加合帶相互重疊px-一個(gè)寬譜帶通常在一個(gè)不易區(qū)分的范圍內(nèi)。目前，去卷積微分等數(shù)學(xué)方法常用于區(qū)分加合帶中不同波數(shù)的每個(gè)吸收峰，最后擬合經(jīng)譜帶獲取每個(gè)吸收峰的定量信息。
紅外光譜儀儀可用于監(jiān)測(cè)酰胺質(zhì)子的交換速率。暴露在表面的質(zhì)子比中心的質(zhì)子好H/D交換要快得多。參與二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的內(nèi)伸縮區(qū)或酰胺質(zhì)子的交換率為中等。它可以提供多肽或蛋白質(zhì)中所有氨基酸殘基的信息。
(4)紫外光譜
紫外可見吸收光譜是研究生物大分子溶液構(gòu)象時(shí)非常重要的方法。它對(duì)測(cè)定樣品沒有特殊要求，只需要處于溶液狀態(tài)，因此紫外光譜可以獲得有意義的信息，探索生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。紫外線范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)(250~3000mm)芳香族氨基酸的光吸收主要是由于Trp及Tyr，其次是Phe和His由電子激發(fā)引起。
(五)圓二色譜
多肽多為手性分子，實(shí)驗(yàn)室主要采用圓形色譜( circular Dichroi ** spectra，CD)研究溶液中分子的立體結(jié)構(gòu)、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和構(gòu)象變化。CD譜具有UV分析相同的精度，但比UV靈敏度高，而且在UV譜中重疊的峰值CD譜中也有可能分開。CD通常是分子橢圓度的測(cè)定[θ]由于分子的光學(xué)不對(duì)稱性，該物質(zhì)對(duì)左右圓偏振光有不同程度的吸收。根據(jù) Cotton效應(yīng)，[θ該值僅在吸收峰值上具有較大的值，并對(duì)應(yīng)于吸收峰長(zhǎng)位置，而多肽紫外吸收光譜主要有兩個(gè)吸收峰值，在280m芳香族側(cè)鏈引起的吸收峰(主要是Tyr、Tp、Phe)，但波長(zhǎng)小于230mm不僅有其它氨基酸側(cè)鏈的電子躍遷，還有肽鏈骨架本身的電子位移引起的吸收，因此，通過這個(gè)區(qū)域CD多肽主鏈的構(gòu)象可以象。
(六)X射線晶體學(xué)
X射線晶體學(xué)是迄今為止研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最有效的方法，其精度是任何其他方法都無法比擬的。缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)/多肽晶體難以培養(yǎng)，晶體結(jié)構(gòu)測(cè)量周期長(zhǎng)。X射線衍射技術(shù)可以準(zhǔn)確地確定晶體中原子的空間位置；中子衍射和電子衍射技術(shù)用于彌補(bǔ)X射線衍射技術(shù)的不足。生物大分子單晶中子衍射技術(shù)用于確定生物大分子中氫原子的位置；纖維生物大分子X射線衍射技術(shù)用于確定螺旋結(jié)構(gòu)等一些周期性結(jié)構(gòu)；電子顯微鏡技術(shù)可以確定生物大分子的大小、形狀和亞基排列的二維圖像；它與光學(xué)衍射和濾波技術(shù)相結(jié)合，可以直接顯示生物大分子低分辨率的三維結(jié)構(gòu)。
除上述方法外，場(chǎng)分析質(zhì)譜、生物鑒定法、放射性同位素標(biāo)記法和兔疫學(xué)法已應(yīng)用于多肽物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定和分析檢測(cè)。
可轉(zhuǎn)載，不可轉(zhuǎn)載 ** 商業(yè)。文章的部分內(nèi)容來自多肽藥物的研發(fā)。